Todo lo que sabemos de Nicodemo en la biblia es tomado del evangelio de Juan. En Juan 3:1, él es descrito como un fariseo. Los fariseos eran un grupo de judíos que eran quisquillosos para guardar la letra de la ley y a menudo se oponían a Jesús en Su ministerio. Muchas veces Jesús los denunció enérgicamente por su legalismo (ver Mateo 23:22). Saulo de Tarso (que se convirtió en el apóstol Pablo) también fue un fariseo (Filipenses 3:5).
Juan 3:1 también describe a Nicodemo como líder de los judíos. Según Juan 7:50-51, Nicodemo fue miembro del sanedrín, que era el cuerpo gobernante de los judíos. Cada ciudad podía tener un sanedrín, que funcionaba como "jurisdicciones inferiores". Bajo la autoridad romana en la época de Cristo, a la nación judía se le permitió un grado de autonomía, y el gran sanedrín en Jerusalén fue la corte final de apelaciones para temas relacionados a la ley judía y la religión. Este es el órgano que en última instancia condenó a Jesús, pero aun así tenían que acudir a Pilato para aprobar su sentencia, ya que la pena de muerte estaba más allá de su jurisdicción en virtud de la ley romana. Parece que Nicodemo fue parte del gran sanedrín en Jerusalén.
Juan informa que Nicodemo vino a hablar con Jesús de noche. Muchos han especulado que Nicodemo tenía miedo o vergüenza de visitar a Jesús a plena luz del día, así que hizo una visita nocturna. Esto puede muy bien ser el caso, pero el texto no da ninguna razón de la hora de la visita. Un número de otras razones también son posibles. Nicodemo cuestionó a Jesús. Como miembro del concilio gobernante judío, su responsabilidad era averiguar sobre otros maestros u otras figuras públicas que podrían llevar al pueblo por mal camino.
En su conversación, Jesús inmediatamente confronta a Nicodemo con la siguiente verdad: "es necesario nacer de nuevo" (Juan 3:3). Al ver la incredulidad de Nicodemo, Jesús lo amonesta (tal vez suavemente) diciéndole que, ya que él es un líder de los judíos, él ya debería saber esto (Juan 3:10). Jesús continúa dando una explicación más detallada del nuevo nacimiento, y es en este contexto en el que nos encontramos con Juan 3:16, que es uno de los versículos más conocidos y apreciados en la biblia.
La próxima vez que encontramos a Nicodemo en la biblia, él está actuando en su cargo oficial como miembro del sanedrín, cuando están considerando qué hacer con Jesús. En Juan 7, algunos de los fariseos y sacerdotes (presumiblemente con autoridad para hacerlo), enviaron a algunos alguaciles del templo para arrestar a Jesús, pero regresaron porque no fueron capaces de hacerlo (véase Juan 7:32-52). Los alguaciles fueron recriminados por los fariseos en autoridad, pero Nicodemo presenta la opinión de que Jesús no debía ser rechazado o condenado hasta que lo hayan escuchado personalmente: "¿Juzga acaso nuestra ley a un hombre si primero no le oye, y sabe lo que ha hecho?" (Juan 7:51). Sin embargo, el resto del concilio rechaza de manera grosera la sugerencia de Nicodemo; parece que ya habían tomado una decisión respecto a Jesús.
La última mención de Nicodemo en la biblia está en Juan 19 después de la crucifixión de Jesús. Nos encontramos con Nicodemo ayudando a José de Arimatea en la sepultura de Jesús. Se describe a José en el evangelio de Mateo como un hombre rico, y en Marcos 15:43 como miembro del concilio. Lucas 23:50-51 dice que José era justo y no había consentido en el acuerdo ni en los hechos de ellos respecto a Jesús. Juan 19:38 describe a José como un discípulo de Jesús, aunque en secreto porque tenía miedo de los judíos. José pidió a Pilatos el cuerpo de Jesús. Nicodemo trajo 75 libras de especias para preparar el cuerpo para el entierro y luego ayudó a José a envolver el cuerpo y ubicarlo en la tumba. La enorme cantidad de especias para el entierro, parecería indicar que Nicodemo era un hombre rico y que tenía gran respeto por Jesús.
El relato limitado en el evangelio de Juan deja muchas preguntas sin respuestas acerca de Nicodemo. ¿Era él un verdadero creyente? ¿Qué hizo él después de la resurrección? La biblia guarda silencio sobre estas preguntas, y no existen recursos extra-bíblicos confiables que den algún tipo de respuesta. Parece que Nicodemo pudo haber sido muy similar a José de Arimatea, en que quizás él también era un discípulo de Jesús, pero todavía no había tenido la valentía de declarar abiertamente su fe. Quizás el registro final de Nicodemo fue su declaración de fe, aunque no se nos dice que tan pública fue. Su presentación en el evangelio de Juan es generalmente favorable, lo cual sugiere que su fe era realmente auténtica.